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免疫胶体金技术ppt课件下载

素材编号:
418465
素材软件:
PowerPoint
素材格式:
.ppt
素材上传:
yangyiner
上传时间:
2020-06-28
素材大小:
1 MB
素材类别:
生物课件PPT
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免疫胶体金技术ppt课件

免疫胶体金技术ppt课件免费下载是由PPT宝藏(www.guywsmith.com)会员yangyiner上传推荐的生物课件PPT, 更新时间为2020-06-28,素材编号418465。

这是免疫胶体金技术ppt课件,包括了胶体金标记技术的相关定义,胶体金技术的发展,胶体金技术的种类及优点,免疫胶体金技术的特点,蛋白与胶体金结合的最佳pH测定,胶体金免疫层析法试剂的组成,硝酸纤维膜的选择,研究和应用等内容,欢迎点击下载。

免疫胶体金技术 Immune colloidal gold technique 
胶体金标记技术的相关定义
胶体金技术的发展 Development of Immune colloidal gold technique
1939-----雏形
            Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。
1971------作为标记物应用于免疫组织化学研究           
             Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合,用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。
1974------实现间接免疫金染色法
             Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上,实现了间接免疫金染色法
胶体金技术的种类及优点
快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA)
            即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。
            主要由两部分组成:膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒,其中填满吸水性物质,面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜,标记结合物为免疫金。
免疫胶体金技术的特点
优点:
检测方法简单而快速,数分钟即可得出结果;
不需仪器设备,操作人员不需特殊训练;
试剂稳定,适用于单份测定;
无污染。
GICA的特点是单一试剂,一步操作。小型实验室即有条件开发生产。
干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。
最近由于原料的精选和制作工艺的改进,已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader,其精密度和准确性均符合定量测定要求。
Colloidal Gold Synthesis
Solution color varies extensively with particle size
Usually a deep red, but also dark brown/purple to light orange/yellow
Colloid size can be controlled by Au:Citrate ratios
Anywhere between 1nm - 100nm +
Citrate is easily substituted by other more Au-philic molecules (i.e thiols)
Procedure of Colloidal Gold Synthesis
Synthesis and properties of different particle size
TEM Images of Colloidal Au
How are the antibodies coupled to the gold?
         Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three separate but dependent phenomena :
a). ionic attraction between the negatively charged gold and the positively charged protein
b). hydrophobic attraction between the antibody and the gold surface
c). Sulfur binding (Cysteine and Methionine)
SAMPLE  GOLD CONJUGATION PROTOCOL
Adjust the gold colloid to the proper pH;
 Determined the minimum amount of protein ;
Final conjugation 
Purification
Adjust the gold colloid to the proper pH
            胶体金与蛋白质的结合成功与否,取决于pH值,一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合,因此,标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。
需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3,需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头,因此,一般用精密的pH试纸测定其pH即可.
蛋白 与胶体金结合的最佳pH测定
取若干1.5ml的试管,分别加入1ml胶体金
用K2CO3将pH分别调为3,4,5,6,7,8,9,10;
去96孔培养板,按pH从高到低分别将上述胶体金分别取100ul加入孔中,重复三次;
每孔分别加入20ul浓度为10%的NaCl溶液,混合,室温下放置10min;
观察胶体金颜色变化,记录保持红色的最低pH
Adjust the gold colloid to the proper pH
常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值
Determined the minimum amount of protein
(1)光电比色法:制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液(1ml),分别加入5ml胶体金中,迅速混匀,然后,各加入1ml 10% NaCl溶液,摇匀,静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小,OD在520~580nm之间测定,以OD值为纵坐标,蛋白质用量为横坐标作一曲线,取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45μg/ml。
(2)目测法:以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例,将标记的蛋白质逐级稀释后(由5μg~45μg另设对照管),各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中,5min后,在上述各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠,依表5-5顺序进行。
1. Pipette 1ml of colloid into each of a series of 3ml clean plastic tubes.
2. Adjust the antibody (0.1ug/ul) to the proper pH with 100nM K2CO3 or 100mM HC1.
3. Add the antibody to each tube in a series from 0-150ul (ie 0-15ug in steps of 0, 1, 2, 3 ....15ug).
4. Shake each tube and leave for approximately 5 minutes to conjugate.
6. To each tube add 100ul of 10% NaC1 and agitate for 1 minute.
7. The Tube containing the minimum amount of protein required to stabilize the gold sol is indicated by the one in which the color of the gold sol does not change from red to blue upon the addition of NaCl.
Final conjugation (IgG)
Take 100ml of gold sol and adjust to Ph9
Adjust the dialyzed and centrifuged antibody solution (0.1ug/ul) to pH9.2
 Add the determined amount of antibody solution dropwise to the gold while stirring rapidly
After 5 minutes add 10ml of filtered 10% BSA at pH9 and stir gently for 10 minutes.
Purification
   The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before concentrating and storing.
 Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle size .
The gold conjugate will form a loose precipitate at the bottom of the tube. Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer.
胶体金免疫层析法试剂的组成
样品垫(Sample pad):
           玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质,多种规格,批间稳定。
    样品垫的作用:
     减缓样品渗透速度,有利于样品在结合垫上均匀分布;
     去除样品中杂质颗粒;
     调节样品液pH值或粘度等。
硝酸纤维膜的选择
膜的分类标准(μm和s)
    μm:  指的是膜孔径,
     s: 以秒为单位的定义为,每4cm膜,水的层析时间是***s.
     换算情况大致为:8um=135s;6um=180s
不同秒数的膜对反应的影响
    通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短,读数快,那么灵敏度也就越低。反之,反应时间长,读数慢,也就灵敏度高。同时还有一个问题是,反应时间越长,发生非特异性结合的可能性就越大,所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。
 135s一般用在双抗体夹心法,180s一般用在竞争法.
如何选择
物理性能
    膜的物理性能主要是2个参数, 膜厚度和宽度
   厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能,点出来的C/T线宽窄不一,另外也影响爬速;
   宽度(检测区的长度)和爬速及灵敏度的关系
跑水性能
    注入足够溶液到槽内,将不同批次膜每隔1cm做一次标记(总长大于4cm)并放到倾斜支架,整个支架下端放入溶液槽,膜开始吸液,计时。记录每个标记处的通过时刻,并与对照组比较。跑板时,理论上溶液呈水平线形式上吸,观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。
点样测试
 C/T线出线时间和灵敏度
研究和应用
THANKS AND BLESSING
 

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